Isolasi Kromosom

ISOLASI KROMOSOM

ALAT :

  1. Tube
  2. Micropipette
  3. Vortex
  4. Shaker
  5. Freezer
  6. Autoclave
  7. Tissue
  8. Tip

BAHAN :

  1. Koloni tunggal E. coli
  2. Medium LB
  3. STE
STE [Stok] [Kerja] Per 200 ml
Tris pH 8 1 M 10 mM 2 ml
EDTA 0.5 M 1 mM 0.4 ml
NaCl 5 M 100mM 4 ml
H2O Sampai 200 ml
  1. Lisozim
Lisozim [Kerja] Per 100 ml
Tris-HCl  pH 8 50 mM 5 ml
EDTA 10 mM 2 ml
Lisozim 5 mg/ml 0.5 g
H2O Sampai 100 ml
  1. Buffer lisis dingin
Buffer lisis [Stok] [Kerja] Per 1 ml
SDS 10 % 2 % 20 µl
EDTA 0.5 M 200 mM 400 µl
H2O 400 µl
Dibuat fresh saat itu juga

Campurkan dengan urutan : EDTA, H2O, SDS

  1. Carbon-isoamilalkohol (C:I, 24:1).
C-I Per 100 ml
Kloroform 96 ml
Isoamil alkohol 4 ml
  1. Fenol
  2. Na Asetat
Na Asetat Per 500 ml [kerja]
Sodium Asetat 204,5 g    3 M
H2O 400 ml
As. Asetat glacial Atur pH 4.8
H2O setelah pH diatur Sampai 500 ml
  1. etanol absolute

10.  TE (Tris EDTA)

11.  Etanol 70 %

Etanol 70 % Per 100 ml
Etanol absolute 70 ml
H2O 30 ml

CARA KERJA

PEMANENAN SEL

  1. Koloni tunggal E. coli ditanam pada medium LB, di inkubasi selama 16 jam di shake incubator 125 rpm.
  2. Setelah itu dituang di tube sebanyak 1.5 ml yang kemudian divorteks selama 5 menit pada 5000 rpm.
  3. Buang supernatant hingga didapatkan pelet sel.
  4. Ulangi cara kerja 3 dan 4 di tube yang sama.

PELEPASAN PLASMID DARI SEL

  1. Tambahkan STE 1 ml pada pelet sel, kemudian divorteks sampai homogen pada 5000 rpm selama 5 menit.
  2. Buang supernatan, lalu keringkan di atas tissue.
  3. Tambahkan lizosim 200 µl, vortex sampai larut, inkubasi pada 37oC selama 1 jam.
  4. Tambahkan buffer lisis dingin 200 µl, bolak-balik hati-hati sampai larut (± 1 menit).
  5. Tambahkan CI/ carbon-isoamilalkohol (C:I, 24:1).
  6. Tambahkan fenol dingin 100 µl, bolak-balik sampai larut.
  7. Divorteks 13000 rpm 10 manit 4 oC.
  8. Pindahkan DNA dengan  menyedot pakai tip tumpul (jangan sampai  proteinnya tersedot).
  9. Diukur volumenya menggunakan tube lain yang berskala.

PEMISAHAN DAN PEMEKATAN DNA

  1. C-I 1x vol supernatant, kemudian vortex di 13000 rpm, 10 menit 40C.
  2. Pindahkan DNA ke tube lain dengan tip tumpul dan jangan sampai proteinnya tersedot.
  3. Diukur volumenya menggunakan tube yang berskala.
  4. Tambahkan Na asetat 3 M pH 5,2 1/10 vol supernatant.
  5. Tambahkan etanol absolute 2x vol supernatant.
  6. Inkubasi 2 jam pada  -200C.
  7. Vortex pada 13000 rpm 10 menit 40C, buang supernatant.
  8. Tambahkan etanol 70% dingin 500 µl, vortex perlahan 30 rpm 10 menit 40C.
  9. Buang supernatant, keringkan sisa etanol diatas tissue, biarkan etanol menguap.

10.  Tambah 50 µl TE (Tris EDTA), vortex perlahan. (DNA terlarut 50 µl)

 

Leave a Reply

Fill in your details below or click an icon to log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Log Out / Change )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Log Out / Change )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Log Out / Change )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Log Out / Change )

Connecting to %s