Isolasi Plasmid

ISOLASI PLASMID

ALAT :

  1. Tube
  2. Vortex
  3. Shaker
  4. Freezer
  5. Autoclave
  6. Tissue
  7. Tip

BAHAN :

  1. Koloni tunggal E. coli
  2. Medium LB
  3. STE
STE [Stok] [Kerja] Per 200 ml
Tris pH 8 1 M 10 mM 2 ml
EDTA 0.5 M 1 mM 0.4 ml
NaCl 5 M 100mM 4 ml
H2O Sampai 200 ml
  1. Larutan I
Lar I [Kerja]
Glukosa 50 mM
Tris pH 8 25 mM
EDTA pH 8 10 mM
Autklave 15 menit dan simpan di 4 0C
  1. Larutan II
Lar II [Stok] [Kerja] Per 1 ml
NaOH 10 N 0.2 N 20 µl
SDS 10% 1% 100 µl
H2O 880 µl
Campurkan dengan urutan : NaOH, H2O, SDS
  1. Larutan III
Lar III [Kerja] Per 100 ml
Kac 5 M 49,1 g
D H2O Sampai 100 ml
  1. Na Asetat
Na Asetat Per 500 ml [kerja]
Sodium Asetat 204,5 g    3 M
H2O 400 ml
As. Asetat glacial Atur pH 4.8
H2O setelah pH diatur Sampai 500 ml
  1. etanol absolute
  2. TE (Tris EDTA)

10.  Etanol 70 %

Etanol 70 % Per 100 ml
Etanol absolute 70 ml
H2O 30 ml

CARA KERJA

PEMANENAN SEL

  1. Koloni tunggal E. coli ditanam pada medium LB, di inkubasi selama 16 jam di shake incubator 125 rpm.
  2. Setelah itu dituang di tube sebanyak 1.5 ml yang kemudian divorteks selama 5 menit pada 5000 rpm.
  3. Buang supernatant hingga didapatkan pelet sel.
  4. Ulangi cara kerja 3 dan 4 di tube yang sama.

PELEPASAN PLASMID DARI SEL

  1. Tambahkan STE 1 ml pada pelet sel, kemudian divorteks sampai homogen pada 5000 rpm selama 5 menit.
  2. Buang supernatant, tambahkan larutan I 100 µl, vortex sampai homogen, simpan die s selama 5 menit.
  3. Tambahkan larutan II 200 µl segar yang dibuat saat itu juga l, dibolak-balik, kemudian disimpan di es selama 5 menit.
  4. Tambahkan larutan III 150 µl, vortex kira-kira 10 detik, simpan dies selama 5 menit.
  5. Di vortex pada 13000 rpm 10 menit 40C, shingga didapatkan pelet berwarna putih.
  6. Supernatant dipindah ketube baru (dituang atau dipipet).
  7. Diukur volumenya menggunakan tube lain yang berskala, hingga diketahui perkiraan volumenya.

PEMISAHAN DAN PEMEKATAN PLASMID

  1. Tambahkan Na Asetat 3M dingin 0.1 x vol supernatant, tambah etanol absolute dingin 2x vol supernatant, bolak balik sampai homogen.
  2. Inkubasi di freezer 2 jam pada -200C.
  3. Kemudian vortex pada 13000 rpm 10 menit 40C.
  4. Buang supernatant dan tambahkan etanol 70 % 1 ml dingin.
  5. Vorteks pada 13000 rpm 10 menit 40C, buang supernatant.
  6. Keringkan sisa etanol di atas tissue, biarkan etanol menguap.
  7. Tambahkan 50 µl TE (Tris EDTA), vorteks perlahan.
  8. Plasmid terlarut 50 µl.

Top of Form

 

Leave a Reply

Fill in your details below or click an icon to log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Log Out / Change )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Log Out / Change )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Log Out / Change )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Log Out / Change )

Connecting to %s